一种克雷伯氏菌噬菌体鸡尾酒疗法，可在体外和体内扩大宿主范围并延缓噬菌体的抗药性

一种克雷伯氏菌噬菌体鸡尾酒疗法，可在体外和体内扩大宿主范围并延缓噬菌体的抗药性

研究背景

1. 全球抗生素耐药（AMR）的严峻挑战

全球范围内，抗生素耐药性已成为 系统的沉重负担，传统抗生素对多重耐药（MDR）病原体如肺炎克雷伯菌的疗效逐渐失效，亟需开发新型治疗方案。

2. 噬菌体疗法的优势与潜力

噬菌体是能感染并裂解细菌的病毒，具有宿主特异性强、可在感染部位自我扩增、副作用小等优势。研究表明，细菌在噬菌体压力下可能发生适应性进化，如生长受抑、毒力降低或恢复对抗生素的敏感性，使其成为兼具 “抗菌” 和 “减毒” 功能的新型生物制剂。美国 FDA 已将噬菌体指定为对抗多重耐药菌的 “紧急研究性新药（eINDs）”。

3. 肺炎克雷伯菌的致病性与治疗难点

高毒力与耐药性：肺炎克雷伯菌，尤其是碳青霉烯耐药株，是临床重要病原体，可引发肝脓肿、尿路感染、败血症等，死亡率高。其荚膜多糖（CPS）有超过 180 种血清型，其中 KL1 和 KL2 型高毒力菌株因黏液分泌过多、侵袭性强，治疗效果差。

宿主范围窄与耐药性问题：多数噬菌体仅靶向单一荚膜类型（如 KL1），导致宿主范围受限；单一噬菌体治疗易诱导耐药突变（如荚膜合成相关基因变异），进一步加剧治疗失败风险。

生物膜形成：荚膜多糖促进生物膜形成，而生物膜内细菌易对药物和噬菌体产生耐药性，成为持续性感染的重要原因。

4. 噬菌体鸡尾酒疗法的必要性

针对单一噬菌体的局限性，“噬菌体鸡尾酒”（多种噬菌体组合）被视为有效策略。它可通过覆盖更广的宿主范围、协同抑制细菌耐药性进化，提升对不同血清型和耐药菌株的杀菌效果。

技术路线

1. 噬菌体分离与耐药菌株筛选

目标菌株选择：以高毒力、抗生素敏感的肺炎克雷伯菌 NTUH-K2044（KL1 荚膜型） 作为初始宿主，从医院污水中分离噬菌体。

初代噬菌体分离：通过双层琼脂法纯化得到噬菌体 ΦK2044，其噬菌斑具有 “中央透明区 + 浑浊晕环” 特征，提示可降解荚膜多糖。

耐药菌株及次级噬菌体分离：长期用 ΦK2044 处理 NTUH-K2044，筛选出耐药突变株 R1 和 R8（荚膜产量减少、黏液性降低），再以这两种耐药株为宿主，从污水中分离出噬菌体 ΦKR1 和 ΦKR8。

2. 噬菌体生物学特性分析

形态与基因组鉴定：透射电镜观察显示，ΦK2044 为无尾多面体衣壳（属 家族），ΦKR1 和 ΦKR8 为有尾结构（属 家族， 属）。

基因组测序表明，ΦK2044 含荚膜解聚酶基因（与噬菌斑晕环形成相关），ΦKR1 和 ΦKR8 基因组较大（165-168 kb），编码多种潜在受体结合蛋白。

关键参数测定：感染复数（MOI）：ΦK2044 最佳 MOI 为 0.001，ΦKR1 和 ΦKR8 为 1。

一步生长曲线：ΦK2044 潜伏期 10 分钟、裂解量 300 PFU / 细胞，ΦKR1 和 ΦKR8 潜伏期 20 分钟、裂解量 65-60 PFU / 细胞。

稳定性测试：三种噬菌体在不同温度（4-80℃）、pH（2-12）及人血清中均保持活性。

3. 宿主范围与耐药性评估

宿主范围筛选：测试 3 种噬菌体对 50 株临床肺炎克雷伯菌（13 种荚膜型，包括 MDR 菌株）的裂解能力。ΦK2044 仅靶向 KL1 型，ΦKR1 和 ΦKR8 可裂解 10 种荚膜型（如 KL2、KL47、KL64），对 MDR 菌株裂解率达 39%-83%。

耐药突变频率检测：单一 ΦK2044 处理耐药突变频率为 3.5×10−6，而鸡尾酒疗法显著降低耐药率（P

4. 噬菌体鸡尾酒制备与体外功能验证

鸡尾酒配方：将 ΦK2044、ΦKR1、ΦKR8 等体积混合（终浓度 1×/mL）。

体外杀菌效果：对浮游菌：鸡尾酒杀菌持续时间（24 小时）显著长于单一噬菌体（6-8 小时），OD₆₀₀检测显示细菌生长受抑更持久。

对生物膜：预防作用：抑制 KL1、KL2、KL47、KL64 型菌株的生物膜形成（结晶紫染色法，P

清除作用： 荧光染色显示，鸡尾酒处理后生物膜内死菌（红色荧光）比例显著高于单一 ΦK2044，且能穿透成熟生物膜基质。

5. 体内疗效验证

感染模型构建：全身性感染：小鼠腹腔注射 NTUH-K2044 等菌株，2 小时后腹腔注射噬菌体（单一或鸡尾酒），监测 7 天存活率、体重变化及组织细菌载量。

导管相关生物膜：小鼠皮下植入预感染 NTUH-K2044 的导管，4 小时后局部注射噬菌体，24 小时后超声处理导管并计数活菌数。

关键结果：存活率：鸡尾酒治疗组小鼠 7 天存活率接近 100%，显著高于单一噬菌体组（40%-70%）。

细菌清除：鸡尾酒组血液、心、肝等组织的细菌载量较单一噬菌体组降低超 ​，肾脏除外。

组织保护：H&E 染色显示，鸡尾酒治疗显著减轻肺、肝、脾、肾的炎症浸润和组织损伤。

导管生物膜：鸡尾酒使导管表面活菌数减少超 ​，抑制生物膜形成效果优于单一噬菌体。

6. 机制探讨与总结

协同作用机制：ΦK2044 靶向 KL1 型菌株，ΦKR1 和 ΦKR8 覆盖更广荚膜型，三者通过 “互补受体识别” 延缓耐药性（如耐药株荚膜合成基因 wzc 缺失）。

创新点：基于 “噬菌体 - 耐药菌共进化” 设计鸡尾酒，兼顾窄谱特异性（ΦK2044）与广谱适应性（ΦKR1/ΦKR8），解决单一噬菌体宿主窄、易耐药的问题。

技术路线图核心逻辑

临床问题驱动（耐药菌感染难治疗）→ 噬菌体分离与改造（从敏感菌到耐药菌宿主，获取互补噬菌体）→ 体外功能筛选（宿主范围、杀菌效率、抗生物膜）→ 体内疗效验证（全身性感染与局部生物膜模型）→ 机制解析与应用潜力（协同杀菌、延缓耐药）。

研究结果

一、噬菌体分离与特性鉴定

三种噬菌体的分离与宿主特异性

从高毒力菌株 NTUH-K2044（KL1 荚膜型） 分离出噬菌体 ΦK2044，其噬菌斑具 “中央透明区 + 浑浊晕环”，提示可降解 KL1 型荚膜多糖，仅靶向 KL1 血清型菌株。

以 ΦK2044 耐药株（R1、R8）为宿主，分离出 ΦKR1 和 ΦKR8，二者宿主范围更广，可裂解 13 种荚膜型菌株（包括 KL2、KL47、KL64 等，覆盖约 50% 测试菌株），对多重耐药（MDR）菌株 KL47、KL64 的裂解率分别达 83% 和 39%。

生物学特性与基因组分析

ΦK2044 属 家族，具短潜伏期（10 分钟）和高裂解量（300 PFU / 细胞）；ΦKR1/ΦKR8 属 家族，潜伏期 20 分钟，裂解量 65-60 PFU / 细胞，基因组较大（165-168 kb），编码多种潜在受体结合蛋白（如尾纤维）。

三种噬菌体在宽温（4-80℃）、pH（2-12）及人血清中稳定性良好，具备体内应用潜力。

二、噬菌体鸡尾酒体外优势

显著延缓耐药性进化

单一 ΦK2044 处理耐药突变频率为 3.5×10，而鸡尾酒疗法将耐药率降低超 10 倍（P

广谱杀菌与持久抑菌

对浮游菌：鸡尾酒杀菌持续时间达 24 小时，显著长于单一噬菌体（6-8 小时），OD₆₀₀检测显示其抑制细菌生长效果更持久。

对生物膜：预防作用：抑制 KL1、KL2、KL47、KL64 型菌株的生物膜形成，结晶紫染色显示生物膜 减少（）。

清除作用： 荧光染色显示，鸡尾酒处理后生物膜内死菌（红色荧光）比例显著高于单一 ΦK2044，且能穿透成熟生物膜基质，活菌数减少超 。

三、体内疗效验证

全身性感染模型（小鼠 / 大蜡螟幼虫）

存活率：感染高毒力菌株后，鸡尾酒治疗组小鼠 7 天存活率接近 100%，显著高于单一噬菌体组（40%-70%）；大蜡螟幼虫模型中存活率超 80%。

细菌载量：鸡尾酒组血液、心、肝、脾等组织的细菌载量较对照组降低超 5lo，肾脏除外，且优于单一噬菌体治疗（P

组织保护：H&E 染色显示，鸡尾酒显著减轻肺（中性粒细胞浸润）、肝（肝细胞肿胀）、脾（淋巴细胞坏死）、肾（血管周围炎症）的病理损伤。

导管相关生物膜模型（小鼠皮下植入）

鸡尾酒处理使导管表面活菌数减少超 4lo，生物膜形成抑制率达 80% 以上，效果显著优于单一噬菌体（P

四、协同作用机制与创新点

互补宿主范围：ΦK2044 特异性清除 KL1 型菌株，ΦKR1/ΦKR8 覆盖更广血清型，三者联合覆盖超 10 种荚膜型，解决单一噬菌体宿主窄的问题。

耐药性进化抑制：耐药株（如 R1、R8）因荚膜合成基因（wzc）缺失导致荚膜减少，ΦKR1/ΦKR8 可识别荚膜外的保守膜蛋白 / 脂质受体，避免因荚膜变异引发的耐药逃逸。

生物膜穿透能力：ΦK2044 的荚膜解聚酶破坏生物膜基质，辅助 ΦKR1/ΦKR8 深入感染部位，协同清除深层细菌。

总结

该噬菌体鸡尾酒（ΦK2044+ΦKR1+ΦKR8）在体外展现出 广谱杀菌、抗生物膜、延缓耐药 特性，在体内显著提升感染模型的存活率、减少细菌载量并保护组织，为治疗高毒力、多重耐药肺炎克雷伯菌感染提供了高效且安全的候选方案。研究验证了 “基于耐药菌共进化筛选噬菌体” 策略的有效性，为优化噬菌体疗法奠定了实验基础。