科研大会 | Daniel Scherman：遗传药理学与基因疗法的进展
中国罕见病科研及转化医学大会由瑞鸥公益基金会于2022年发起，旨在促进全球罕见病科研与转化的学术交流，并搭建产学研医患多方交流与合作的平台。截至目前，大会已于2022年11月（杭州）和2024年5月（上海）举办两届。
第二届中国罕见病科研及转化医学大会设有20个议题，邀请了来自全球20个国家和地区159余位从事罕见病科研与转化的专家学者进行学术交流。大会共计1680人注册参会，会议期间举办实地走访、线下交流15场，专题研讨会及卫星会10场。
讲者
法国罕见病基金会主席
巴黎西岱大学教授
欧洲科学院医学与生命科学学部主任
欧洲科学院院士
首先非常感谢Kevin和主办方举办的这次盛会，今天想跟大家分享下我们实验室的一些成果。在我们刚开始这个非病毒基因治疗研究之旅的时候，我们已经发现DNA不是一个非常好的载体，因为它无法轻易进入细胞核。但是我们找到了克服这个困难的方法。在30年前我们也尝试了一些mRNA实验，那时候mRNA技术还不够高效成熟。刚刚我们看到了教授回顾AAV、慢病毒等病毒疗法的进展。
我其实不喜欢这些病毒，我会觉得病毒载体的技术发展太快，所以我讨厌AAV、慢病毒等等。但是有一个病毒让我很高兴，在此我要感谢它，那就是COVID-19。正是因为COVID-19，我们才有了mRNA疫苗，有了脂质和脂质技术以及我们开创的LNP的复兴。
我记得30年前跟我的朋友聊天，我们会觉得未来是属于病毒载体的，我们没有选对赛道。现在我们明白，基因治疗的每一种技术，无论是病毒还是非病毒载体，都有用武之地。这就是我今天要向大家介绍的内容。
利用基因沉默降解病理mRNA
这是巴黎药学院，一座美丽的建筑，位于巴黎市中心，欢迎大家前来参观。我们得到了许多大学、法国国家科学研究中心（CNRS）和法国国家医学研究中心（）的支持。非病毒基因疗法的有效靶标之一，是针对功能获得型罕见病的mRNA，这种罕见病的病理蛋白是由功能获得型突变表达的。
在这种情况下，你的目标是降解病理 mRNA——有两种方法可以做到这一点。要么，你可以使用反义寡核苷酸（ASO）；要么，你使用沉默 RNA，这是一种双链、约25个碱基对的小RNA。在过去几年中，这种技术已被证明是一种非常有效的体内沉默病理mRNA的技术，比如遗传性转氨酶淀粉样变性中的转氨酶。
我的意思是，你们可能都知道这种机制。小干扰RNA将被送入细胞。它将被一种名为RISC（RNA诱导的沉默复合体）的蛋白复合体吸收。这个RISC系统将摆脱并释放有义链，然后它将只被反义链加载，并以完美的碱基互补识别与目标mRNA 退火。因此，从根本上说，这是一种完美的药物。单个siRNA只针对一种mRNA，这将导致mRNA降解，然后就有了某种催化机制。
这是一个催化过程，因为RISC系统仍然含有反义，它能够找到另一个mRNA并降解另一个mRNA。因此，这是一个具有高度催化作用的、非常强大和活跃的过程。
我将介绍一些工作——LNP已被证明能非常有效地将siRNA运送到体内，但主要是肝脏。我们在这项技术中遇到的问题是，当你把脂质siRNA添加到阳离子或LNP囊泡中时，你可能会遇到稳定性问题，因为大多数siRNA都会被血清降解。因此，解决这个问题的方法是在脂质表面涂上聚乙二醇（PEG）。
这种PEG脂质覆盖的纳米粒子可以有效地转染或递送到肝脏，因为在肝脏中，有一个含有载脂蛋白E的系统，它能与聚乙二醇结合，并与肝细胞上的受体结合，将siRNA运送到肝细胞。因此，对于肝脏，我们确实解决了这个问题，但对于其他组织，这就很困难了，因为当你用聚乙二醇覆盖颗粒时，你就失去了将siRNA有效载量输送到组织的能力。我们正在寻找另一种技术，但我们仍然只有基于阳离子脂质的技术，仍然存在血清不稳定的问题。
APIRL，一种有效的siRNA递送系统
我们开发的技术被称为APIRL(阴离子聚合物干扰RNA脂质体)。我们的想法是，为什么这种阳离子脂质能与血清解离？如果用质粒DNA来做，它是一种大分子，特别稳定。而siRNA（小核苷酸）则不稳定。因此，我们决定添加某种非编码质粒DNA作为聚合胶，以保持颗粒在循环中的稳定性。我不会详述细节，但这是基本概念。因此，你有一个由阳离子脂质（即我们30年前开发的）和中性二磷脂酰烯醇胺组成的阳离子颗粒，再混合阴离子聚合物和siRNA有效载量，你就有了三重复合体。
我们不深入到全部机制论证的细节。这是一个胶原蛋白诱发关节炎模型的例子，在这个模型中，你会看到肿胀得非常厉害，而临床评分基本上很容易通过肿胀来测量。因此，在这里你看到的是一种与siRNA对照或抗TNF-α的siRNA混合的siRNA纳米粒子的临床评分。TNF-α是参与炎症过程的主要细胞因子，或者在颗粒中加入抗TNF-α的siRNA和聚阴离子聚合物。
这是临床评分。所以，根本没有接受治疗。而这是使用经典的阳离子脂质和抗TNF-α的siRNA。这里显示的是水平，但当你使用这种带有阴离子聚合物的配方时，你就能完全阻断疾病。关节炎完全消失了，治疗效果与甲氨蝶呤相同，而甲氨蝶呤是治疗这种病症的金标准。
这是另一个实验，在同一个模型中，我们加入了siRNA对照或抗细胞因子（L-1或IL-18或IL-6）的siRNA，或每种siRNA的三分之一剂量，但三种siRNA混合使用。你会发现，你可以调配出一种鸡尾酒，在使用相同数量siRNA分子的情况下，鸡尾酒疗法的效率要高得多。
因此，将两种抗炎药、两种抗细胞因子、两种抗体或两种siRNA混合在一起，很容易测试是否存在某种协同作用。你可以进行大量实验，确定在特定病理情况下可能需要哪种协同抗细胞因子组合。
我想介绍的另一个例子是骨肉瘤模型。这是一块正常的骨头，而这就是你在骨肉瘤中观察到的情况。实际上，骨肉瘤患者的问题在于他们会破坏自己的骨骼。
骨肉瘤会激活破骨细胞，而破骨细胞是降解骨骼的细胞，因此骨骼会遭到破坏。在骨骼中，破骨细胞和成骨细胞之间始终保持着平衡，而骨肉瘤正在产生RANKL配体，这是一种炎症激活细胞因子，RANKL配体将激活破骨细胞，使骨骼退化。因此，使用我们的纳米粒子进行局部治疗时，你看到的是骨肉瘤效应对骨骼的实际破坏。没有siRNA就没有效果，需要使用抗肿瘤化合物异环磷酰胺进行治疗。如果使用siRNA RANKL配体抑制细胞因子RANKL配体，就能完全保护骨骼，减少肿瘤生长。这也是使用这种制剂可以观察到的协同效应。
我想说的是，我们也在肝脏上做过实验，siRNA的有效期是两周。但现在有了新技术，通过非常有趣的化学修饰，有了硫代磷酸酯和所有这些东西，现在新的siRNA变得非常有效，一剂siRNA可以持续至少9个月。
我们正朝着每年注射一次siRNA治疗的模式发展。当然，每两周注射一次siRNA有效载量可能会非常昂贵和困难。现在有了这种长效siRNA，我们可能会重新审视这种药物的许多治疗潜力。
这只是为了说明，使用这种微粒，我们也能相当有效地向肝细胞递送 siRNA，几乎所有肝细胞都能吸收 siRNA。总之，我想说的是，我们证明了可以使用临床上可用的厌氧聚合物，如海藻酸盐和聚谷氨酸盐，它们确实具有与这种微粒相同的效果。这种 APIRL 具有充分的特性，在体外和体内都很有效。它可以制成siRNA鸡尾酒，很容易适应体内模型，分布广泛，包括关节内和关节外，这是其他颗粒无法做到的，我们希望并愿意与各方合作。
质粒：基因治疗载体的开发与应用
好了，现在我将完全换个话题，谈谈非病毒质粒。
质粒是非常重要的工具，过去30年来，我一直从事质粒领域的研究，质粒无处不在，你知道，有很多公司在研究AAV，但使用质粒的公司都相当成功——因为你需要质粒来制造AAV，你需要质粒来制造慢病毒，但质粒本身就能构建治疗载体，质粒还是模板，是mRNA、mRNA疫苗的必要模板。
因此，质粒是游戏的核心。那么什么是质粒呢？有几种递送质粒的技术。我提到过阳离子脂质，我将介绍我和我的团队在20年前开发的电转移技术。
但我们也可以改进基因表达载体，即质粒本身。为什么呢？因为这是一个质粒，这是一个经典的质粒，你们都见过这种示意图——这里有治疗盒、启动子基因和 polyA，这里有初始的复制和抗生素抗性基因选择标记。
实际上，我们想去掉这部分，因为这是一个原核序列，我们不需要它来进行基因治疗，尤其是体内基因治疗。因此，第一种方法是删除质粒的这一部分。第一，安全因子，因为如果在体内施用质粒，你不希望传播数十亿抗生素耐药序列。第二，递送/扩散因子，因为我们已经证明，较小的质粒更适合转染，转染缺陷率更高。第三，免疫因子，因为原核生物骨架含有较多的CPG，而CPG是免疫炎症序列。第四，表观遗传因子，因为我们已经证明，骨架较小的质粒在肝脏中不易发生表观遗传沉默，斯坦福大学的Mark A. Kay团队也证明了这一点。第五，转录效率因子，可提高小质粒合成mRNA的转染效率。此外，我的朋友、质粒工厂的 发表了这篇论文。他们发现，在三重转染质粒后产生AAV时，会受到原核生物序列的污染。
例如，在单链AAV中，我们发现3%的AAV含有原核生物序列，但在双链、自身互补AAV中，他们发现高达26%的质粒生产受到了质粒中原核生物序列的污染。因此，我们有理由去除这种原核序列。
我的第一项工作就是开发这项技术。我们制作了一个亲本质粒，然后进行热转变，诱导质粒内分子重组，最后生成一个迷你质粒，它有一个原核生物骨架和一个迷你圆环，其中只包含基因治疗载体。这项技术已授权给质粒工厂，由德国的质粒工厂按照GMP标准进行工业化生产。但这相当复杂，因为在制备过程中必须将这三个实体分开。因此，质粒工厂解决了一些技术障碍。与此同时，我开始使用一种新技术，我称之为pFAR质粒。就选择标记而言，这种迷你质粒只包含一个sub-tRNA。
我没有时间解释它是如何工作的，但我们不使用任何抗生素。我们的细菌宿主发生了某种突变，而我们只使用了一种缺乏必需碱基的培养基，我们没有更多的抗生素来生产我们的质粒。
这是一个技术应用的例子，黏多糖贮积症Ⅶ型。这是一种溶酶体类固醇紊乱，缺乏酸水解β-葡萄糖苷酸酶的罕见疾病。目前还没有治疗这种疾病的方法，你在小鼠身上看到的是糖胺聚糖在脑内多个器官的溶酶体进行性积累。因此，我们在小鼠身上使用的技术叫做流体动力递送，利用尾静脉水动力给药。它是由美国的刘教授发明的，效率非常高。你向尾静脉递送的量很大，大约2毫升，然后就会有某种逆流进入肝脏，这样就能将质粒强制送入几乎所有肝细胞。刘教授一直在尝试将这种方法应用于人体，并且他已经证明了这种方法的价值。在猪的特定肝叶中，这种方法很有效。
随着技术的进步，我们或许可以通过这种流体动力递送方式将质粒送入人体肝脏，但AAV的效果如何，我们不得而知。我们的优势在于，不会产生针对递送载体的免疫反应。因此，这是我们递送迷你质粒的一个例子，如果我们递送的是正常质粒，那么我们的数量要少50倍，而且我们在肝脏中会产生沉默。
160天后，我们确实获得了非常高的含量。实际上，我们获得的量是缺少氨基磺酰基酶的野生型酶量的10倍。因此，这项技术非常高效，非常强大，而且在肝脏中很稳定。
所以，这就是我告诉你们的——没有表观遗传沉默。通常，你会在肝脏中观察到非常非常快的表观遗传沉默。有了这种迷你质粒，就不存在表观遗传沉默，因为表观遗传机制（沉默机制）是从原核序列开始的，原核序列太小，表观遗传沉默机制无法与之结合，也就无法开始沉默启动子。
因此，我们观察到的是肝脏。你看，这是糖基新生糖酸的水平，这是在注射尾静脉质粒后的结果，这是在未经处理的野生型中的结果，你看，我们在第30天后又迅速恢复到了更安全的水平。
有趣的是，在大脑中也能看到这种减少。但流体动力能将质粒递送到肝脏。因此，我们在这里看到的是，通过持续生产肝脏蛋白，我们确实有了一些大脑渗透。在这个模型中，血脑屏障在某种程度上发生了渗漏，希望通过肝脏持续产生治疗蛋白，可以对大脑进行某种治疗。
电转移技术：肌肉和听力损失治疗的新突破
我想介绍一下我开发的另一项技术——这是25年前发表在《PNAS》上的论文，即电转移技术。电转移的原理是，如果将细胞置于电场中，阴离子就会向阳极聚集，阳离子则会向阴极聚集，这样就会产生电压势能，使膜发生渗透。电荷密度与细胞半径成正比，因此跨膜电位也与细胞半径成正比。如果膜电位足够高，就会使膜通透。
因此，根据这一定律，你会发现对于大细胞来说，需要的电压比细菌等更低，因为半径已经足够了。因此，根据这种理论定律，我们发现肌纤维是非常大的细胞，它能够在比肿瘤细胞等所需电压低得多的电压下电穿孔、电转移肌纤维。
事实正是如此。我们发现其机制如下。加入质粒后，产生中等强度的电场，大约每厘米80-150伏特，由于电场较低，所以脉冲时间较长，能量较低，这样就能电穿孔膜，电场也能将质粒移动到细胞内。事实证明，这种方法在肌肉中非常有效，而且由于电场较低，你可以增加脉冲方向，在我们开始研究之前，使用的脉冲方向是100微秒，而我们可以增加到20毫秒，通过这种技术，荧光素酶的表达量大幅增加了100倍。因此，你可以看到，例如，这是裸DNA到肌肉，这是电转移质粒DNA到肌肉。
这项技术实际上是与我在悉尼一所医学院的朋友Gary 合作进行临床开发的，Gary一直在用我们的迷你质粒pFAR，尝试用这项技术治疗听力损失。大家都知道，由于先天畸形，包括罕见病，听力损失患者的数量在不断增加。听力损失可能是由于耳蜗感觉上皮细胞（如毛细胞、支持细胞或血管纹）受损所致。
我给你们展示一下耳蜗。在这里，你可以看到耳蜗和耳前庭，这里有三个螺旋形的空腔，空腔里有内毛细胞和外毛细胞，他们都会振动，而声音则通过这些振动传到这里的神经，传到这里的螺旋神经，这里就有了螺旋神经节——这是正常的情况。如果人失去了这些细胞或有基因缺陷，他们就没有这些内毛或外毛细胞，这里的神经元就会退化。
因此，我们计划做的就是尝试改进目前唯一的解决方案，即植入人工耳蜗。这是一项在澳大利亚开发的令人难以置信的技术，它有一个发射器，将声音传送到接收器，接收器通过一个由大约20个微电极组成的阵列传送声音，并通过傅里叶变换进行解卷积，因此你可以将声音转换成不同的频率，每个电极发出不同的频率，这将通过重建向听觉神经传递某种刺激。不过，这并不完美，因为人们会失去很多声音的细节，也无法同时与三个人交谈。
这就是原因，因为你有一些距离，你已经失去了所有这部分，你这里的螺旋神经退化了，因为电极在这里。
我们和Gary一起做的是在这里电转移一种神经营养因子，以诱导这种外周神经、螺旋神经的生长。实际上，你使用电极阵列注入脑源性神经营养因子的DNA，你看到的是间充质细胞。而下面是什么，恐怕你看不到，但这是一个退化的神经，如果你注射神经生长因子BDNF，你会看到螺旋神经大量再生。
因此，我们在豚鼠身上看到了再生，而在人类患者身上也是如此，根据CUNY评分，患者的CUNY评分有所提高。目前，我们已在澳大利亚治疗了15名患者，效果相当不错。因此我们很高兴，1、2 期临床试验很有希望，我们计划继续推进这项技术。
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