【综述】噬菌体治疗细菌感染的临床应用与进展
单位：解放军总医院第一医学中心
摘要
噬菌体是一类可以感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称。噬菌体被应用于临床抗细菌感染治疗已有100多年的历史，但因抗菌药物的发现及广泛使用使其逐渐淡出了人们的视线，仅少部分国家与学者仍坚持临床应用至今。在抗菌药物耐药问题日益严重、临床应对策略匮乏的今天，噬菌体治疗重新回到了人们的视野中。噬菌体作为抗细菌感染治疗的优势为特异性强，仅针对目标宿主菌，对周围其他菌株无影响，当目标宿主菌被杀死后衰减并被清除。自然界中噬菌体资源丰富，而且它们与细菌共同进化，几乎在任何时候均可根据临床的需求分离到针对致病细菌的噬菌体。另外，由于抗菌机制不同于现有的抗菌药物，噬菌体治疗对于所谓的"超级细菌"同样有效，且可破坏生物被膜，降低"超级细菌"的耐药性，与抗生素联合应用有很好的协同作用。噬菌体治疗也有其局限性，如噬菌体的分离、纯化与保存有一定难度。本文主要讨论噬菌体临床治疗的历史与现状，并预测噬菌体的发展潜力。
噬菌体是一类可以感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，广泛存在于自然界之中。自其被发现以来已有100余年的历史，但由于抗生素的出现，噬菌体疗法并未被重视及广泛应用，仅东欧个别国家坚持临床应用至今。近年来，随着抗生素耐药问题的日益严重，高水平耐药的"超级细菌"不断出现，而新型抗生素的研发又远远落后，因此，噬菌体治疗重新回到了临床医生的视野中，成为新近研究的热点问题之一。
一、噬菌体简介
1．噬菌体的发现：
1896年英国学者 在印度恒河中首次发现了一种对霍乱弧菌有抑制作用的物质，他发现在印度Agra城市的入口处河水中霍乱弧菌的数量为10万个感染单位，而在出口处霍乱弧菌数量降至90个感染单位，他认为河水中存在某种对霍乱弧菌有抑制作用的物质，该现象被称为现象，这篇报道是噬菌体首次非官方的发现 [1] 。1915年，英国 Twort医生发现葡萄球菌培养物的滤液可裂解其他葡萄球菌菌株，并形成清晰的噬菌斑，考虑为病毒所致；2年后D′在巴黎官方提出了上述噬菌斑是由病毒感染细菌所致，并正式提出"噬菌体"这一概念，在此基础上，D′创造性提出了噬菌体可用于治疗人类和动物的细菌感染，即噬菌体治疗 [2] 。1919年他首次在巴黎的- 儿童医院应用噬菌体成功治愈了1例细菌性痢疾患儿，由此噬菌体治疗正式登上了抗感染治疗的历史舞台并迅速发展，欧洲及美洲的多名学者将其应用于细菌性痢疾、葡萄球菌引起的皮肤感染以及霍乱等的治疗。20世纪40年代，青霉素逐渐实现了规模化生产并广泛应用于临床，美国和大部分西欧国家的科学家基本放弃了对噬菌体的研究，但东欧一些国家，主要是格鲁吉亚、波兰和俄罗斯（包括前苏联），目前仍坚持进行噬菌体研究与临床应用。
2．噬菌体的分类：
噬菌体种类繁多，数量巨大，在自然界中可以达到10 31 (约为细菌数量的10倍)；噬菌体分布广泛，如其最初被发现一样，在液体环境中相对更容易分离到噬菌体，如河流、湖泊、城市废水等。噬菌体有严格的宿主依赖性，根据噬菌体与宿主菌的关系可分为两类：一类是将遗传物质整合于宿主菌的基因组中，随着宿主菌的染色体复制而复制，并通过宿主菌染色体的分裂传给下一代，这种复制过程不会引起宿主菌裂解，称之为溶原性噬菌体（温和噬菌体）。另一类称之为裂解性噬菌体（毒性噬菌体），其复制周期相对较为复杂，且引起宿主菌裂解，主要有以下4个过程：（1）吸附：噬菌体表面蛋白和宿主菌受体特异性结合，使噬菌体吸附在宿主菌上；（2）穿入：噬菌体尾部的裂解酶溶解宿主菌的细胞壁，把储存在噬菌体头部衣壳内的遗传物质——核酸注入宿主菌内；（3）合成：核酸进入宿主菌后，宿主菌以噬菌体核酸为模板，复制生成子代噬菌体的核酸以及合成噬菌体需要的蛋白质；（4）装配与释放：子代噬菌体的核酸和蛋白质合成后，在宿主菌内装配成完整的子代噬菌体，当子代噬菌体达到一定数量后就会裂解宿主菌，释放子代噬菌体，继续吸附周围环境中的宿主菌。临床采用的噬菌体治疗绝大部分是指筛选出特异吸附目标的宿主菌为裂解性噬菌体，利用其复制增殖过程达到破坏目标宿主菌的目的；在宿主菌被清除后噬菌体随即衰减，被网状内皮系统清除。也有少数噬菌体治疗是指利用裂解性噬菌体产生的裂解酶直接破坏目标宿主的细胞壁来杀死宿主菌，达到临床治疗的目的。
基于噬菌体自身的特性，溶原性噬菌体将遗传物质整合于宿主菌的染色体中，称之为"前噬菌体"，其具备高度的自身调节能力及进化潜力，随着宿主菌染色体的复制而复制，在某种特殊条件下，前噬菌体可从宿主菌的基因组中释放并进入裂解周期，感染相关宿主菌。文献报道，前噬菌体通过一个被称为"仲裁（）"的噬菌体编码肽系统决定是否进入裂解周期的生存策略，这是一个调节宿主菌与噬菌体之间生态平衡至关重要的"开关"，但其具体机制尚不清楚 [3] 。
二、噬菌体的临床研究历史
1919年D′在巴黎成功应用噬菌体治愈细菌性痢疾患儿后，在前抗生素时代，噬菌体治疗迅速引起了学者们广泛的关注。1923年， 在格鲁吉亚的第比利斯市建立了噬菌体研究所（ of )，并于1933年与D′协作，在噬菌体研究所的基础上创建噬菌体微生物学和病毒学研究所（ of and ，IBMV），后来逐渐发展成为世界上最大的噬菌体研究和生产中心并延续至今。由于以青霉素为代表的广谱抗生素的发现和广泛应用，使大多数欧美国家放弃了噬菌体的临床应用与研究，仅少数国家持续临床应用至今。最广泛的噬菌体治疗研究是在前苏联进行的，多年以来研究所始终专注于噬菌体的研究和生产，该研究所成为前苏联卫生部的一个分支，广泛应用于医学领域，如外科、妇科、泌尿科、眼科等，主要使用的是研究所自制的噬菌体"鸡尾酒"制剂，这种疗法最初出现于1976年的法国，主要是指制备同时包含几种噬菌体的复合制剂以拓宽抗菌谱，和（或）提高针对某一致病菌的杀菌效果。前苏联解体后，研究所仍然在噬菌体治疗的临床研究与应用上持续前行 [2,4,5] 。
同样在波兰，建于1952年的 研究所也是一所著名的个性化噬菌体治疗研究中心，至今已累计治疗了数千例患者，其临床有效率与研究所报道的结果相似，同时他们还做了一些关于噬菌体治疗相关免疫反应的临床研究：在2008—2010年对153例患者的临床研究中，未发现与噬菌体治疗相关的不良免疫反应，同时也证实了噬菌体治疗效果与免疫反应无关 [6,7,8] 。
近年来，随着高水平耐药致病菌威胁的不断增大，噬菌体治疗重新引起了西方国家医生们的关注，开始将噬菌体治疗应用于患有高水平耐药致病菌感染且临床无法提供有效抗感染方案的病例并取得了较好的临床疗效 [9,10,11] 。同时，关于噬菌体的临床研究也在西方其他国家逐渐展开：2009年由美国学者报道的一项应用噬菌体治疗下肢静脉溃疡感染的随机、双盲、对照Ⅰ期临床试验结果证实了局部应用噬菌体治疗的安全性 [12] ；英国的一项应用噬菌体治疗铜绿假单胞菌感染性中耳炎的研究 [13] ，是经过英国药品和保健产品监管机构（MHRA）和中央研究伦理委员会（COREC）批准的随机、双盲、安慰剂对照的Ⅰ/Ⅱ期临床试验；在法国，2015年1月启动了一项关于耐药金黄色葡萄球菌所致骨和关节感染以及糖尿病足溃疡噬菌体治疗的研究项目（; ）；德国的一项由政府支持的"研究"于2017年9月启动并在柏林的大学医院进行 [14] ，主要研究应用高纯度噬菌体吸入治疗肺囊性纤维化及非囊性纤维化的支气管扩张患者铜绿假单胞菌引起的慢性感染，旨在研究纯化吸入噬菌体鸡尾酒制剂对铜绿假单胞菌所致慢性气道感染的安全性、耐受性和疗效；同年，全球第一项应用噬菌体治疗泌尿系统感染的随机、双盲、对照前瞻性临床研究在瑞士展开 [15] ；欧洲的""临床研究 [16] 是一项多中心随机、对照、双盲研究，前期试验涉及比利时和法国的9个烧伤中心。
三、噬菌体治疗的临床应用
（一）噬菌体制剂的临床用法
1．全身应用治疗：
在"前抗生素时代"，噬菌体是治疗细菌感染的主要方式，最初的临床应用主要针对霍乱、鼠疫及细菌性痢疾等传染性极强的细菌感染性疾病，应用的途径包括了口服与静脉两种；目前临床上仍主要为静脉及口服应用，虽具体应用剂量尚无公认的标准，但已发表的相关文献均提示临床疗效良好 [4,5,6,7,8,9,10] ，且安全性与耐受性良好。
2．局部应用治疗：
与多数抗生素相似，噬菌体制剂也可以局部应用于感染部位，包括暴露创口的直接外用、感染囊腔（如脓肿、中耳炎、膀胱）内保留灌注等方式，部分病例可采用序贯或联合静脉滴注噬菌体制剂或抗生素进行治疗。等 [17] 报道了1999—2000年在格鲁吉亚接受治疗的96例患有血管相关性皮肤溃疡但标准临床抗感染治疗无效的患者，所用的制剂为一种名为""的外用缓释生物聚合物，主要治疗成分包括噬菌体、环丙沙星及镇痛药，结果显示70%的患者完全愈合，25%的患者溃疡好转，仅5%的患者无明显改善（这些患者血糖控制均欠佳），且所有患者（治疗6 d至15个月）均未出现不良反应。Fish等 [11] 使用噬菌体局部注射的方法成功治疗1例63岁糖尿病患者远端趾骨骨髓炎。
3．肺部感染吸入治疗：
肺部吸入治疗也应属于局部治疗的一种，但考虑到高水平耐药致病菌很多来源于肺部感染，故将其单独描述。可应用于吸入治疗的噬菌体制剂主要分为两类：液体制剂（包括混悬液制剂、脂质体包封制剂）与固体制剂（吸入干粉制剂）。与液体制剂相比，干粉制剂不仅大大提升了转运与使用的便捷性，更可明显延长噬菌体制剂的储存时间与稳定性，因此也被认为是未来吸入治疗的主要研究方向。目前研究所使用的噬菌体制剂基本为"鸡尾酒"制剂，即几种噬菌体混合制剂，呼吸系统相关临床研究主要集中在结构性肺病患者（如肺囊性纤维化、支气管扩张等）合并慢性细菌感染的治疗。研究所与格鲁吉亚国家囊性纤维化中心合作，对一组患有囊性纤维化的儿童进行了噬菌体治疗的初步研究，结果显示所有患者的临床症状改善。近几年来研究所治疗了至少16例患有肺部感染的囊性纤维化患者，其临床症状及肺功能明显改善，细菌负荷明显减少 [4] ，且安全性良好。
但吸入治疗也有一定的局限性：首先，雾化制剂的稳定性是噬菌体依赖性的，不同种类的噬菌体、不同的温度与湿度都可能影响治疗效果 [5] ，是动物模型实验乃至临床研究需要考虑的因素；其次，不同吸入方法使噬菌体制剂最终在肺部的分布不同，雾化吸入装置可对噬菌体的结构造成一定的破坏（即头尾分离），干粉制剂在制备的过程中由于机械研磨也可能造成噬菌体滴度的降低，同时，应用不同的吸入方法噬菌体颗粒在肺部的生物分布也明显不同，上述因素所导致的到达下呼吸道噬菌体滴度的降低均可影响治疗效果；最后，噬菌体制剂制备所需的不同的缓冲剂、赋形剂等配伍成分可明显影响制剂本身的稳定性，且无论雾化吸入还是干粉吸入，小分子颗粒本身即可刺激支气管引起痉挛，这也是影响治疗效果不可忽视的原因之一。整体而言，下呼吸道感染的吸入治疗具有较高的安全性和便捷性，美国食品药品监督管理局对噬菌体治疗表达了积极的看法并希望能够制定相应的指南 [18] ，但制剂的效价与稳定性、吸入的方式等还需要基础与临床研究进一步完善。
4．噬菌体裂解酶治疗：
在裂解性噬菌体感染细菌的过程中，共有2种裂解酶：噬菌体用第一种噬菌体裂解酶（称为病毒相关肽聚糖水解酶，- ）在吸附局部降解宿主菌细胞壁，使肽聚糖层产生孔洞用于注入噬菌体核酸，同时噬菌体颗粒结构与孔洞周围结合以避免肽聚糖层发生广泛损害；在复制周期结束时产生第二种噬菌体裂解酶，是一种游离的可溶性蛋白质，称为噬菌体内溶素（phage ），在遗传编程的时间点，由噬菌体基因组编码的穿孔素（）蛋白释放内溶素或激活先前分泌的内溶素分子，这些内溶素从内部广泛降解肽聚糖层，导致细菌细胞裂解并释放出子代噬菌体。
目前临床研究应用的裂解酶多为内溶素，文献报道在体外实验及动物模型中，纯化重组噬菌体内溶素针对相应的革兰阳性、阴性细菌，不仅可破坏其生物被膜，还可诱导其快速裂解并死亡 [19,20,21] 。2017年荷兰学者报道了应用重组噬菌体内溶素（ SA.100）成功治疗3例慢性皮肤金黄色葡萄球菌感染的病例 [22] 。是近期研究最为突出的一种新型噬菌体内溶素注射制剂，含有的重组噬菌体内溶素SAL-1（rSAL-1）为其杀菌活性成分，用于治疗葡萄球菌感染，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（VRSA） [23,24] ，目前已在多种动物模型中证实了临床应用的安全性 [25,26] ；同时在小鼠金黄色葡萄球菌肺炎模型中证实，经鼻吸入治疗可明显降低细菌负荷及小鼠的病死率 [27] ；韩国学者于2013—2014年进行了全球首个由健康志愿者参与的Ⅰ期临床试验 [28] ，结果显示静脉输注的安全性良好，不良反应主要为轻度且呈自限性，与剂量呈正相关，用药后未发现"抗药性"，这些结果提供了很好的临床依据，的后续临床试验值得期待。
5．噬菌体与抗生素联用：
噬菌体杀菌机制与传统抗生素完全不同，这也意味着噬菌体与抗生素联合应用理论上可能存在协同效应。-ó等 [29] 应用噬菌体联合不同种类、不同浓度的抗生素对铜绿假单胞菌进行了体外敏感性实验，结果显示联合治疗具有显著的协同效应。等 [30] 应用噬菌体联合环丙沙星治疗铜绿假单胞菌心内膜炎小鼠模型，同样取得了明显的协同效应。Aslam等 [31] 报道1例金黄色葡萄球菌引起的植入左心室辅助装置感染并发胸骨骨髓炎的患者，在反复清创及长期抗生素治疗效果欠佳后，改为抗生素联合噬菌体静脉治疗，感染完全治愈且未复发。Chan等 [32] 在应用噬菌体OMKO1联合抗生素治疗1例多耐药铜绿假单胞菌引起的主动脉植入物感染的患者过程中发现，对噬菌体敏感的菌株对头孢他啶与环丙沙星耐药性高，而产生噬菌体抗性的菌株对头孢他啶与环丙沙星恢复了敏感，MIC值明显降低。
（二）噬菌体治疗的优势与局限性
噬菌体广泛存在于自然界中，几乎是一种无限的资源，噬菌体与细菌伴行性生存的特点也意味着只要通过合适的方法，均可以找到针对某种宿主菌的裂解性噬菌体。噬菌体对于环境中其他细菌并无杀伤作用，可最大程度降低对于周围环境的影响。噬菌体治疗（包括纯化重组内溶素）在临床治疗过程中均表现出良好的安全性与耐受性。除此以外，噬菌体治疗可有效破坏多种致病菌形成的生物被膜，这也是噬菌体治疗在慢性感染去定植中"表现优异"的重要原因之一，同时也为临床探讨抑制高水平耐药菌株生物被膜形成提供了新的可能与方向 [19,20,21,33,34] 。
噬菌体治疗除以上优势外，也存在不足及局限性。由于进化压力的选择，细菌针对噬菌体感染也产生一些相应的对抗机制，可分为以下4类：（1）防止噬菌体吸附；（2）阻止噬菌体核酸进入；（3）降解噬菌体核酸；（4）流产感染系统（子代噬菌体无法完成装配及释放）。但细菌及噬菌体数量庞大，机制复杂，目前尚未完全清楚其所有的作用机制。
在噬菌体复制的最后阶段，噬菌体通过裂解细菌细胞壁破坏宿主菌，同时释放子代噬菌体，而在革兰阴性杆菌的细胞壁中有一种独特的成分——脂多糖，也就是俗称的"内毒素"，在菌体破坏时内毒素可随细胞碎片释放入血，引起炎症反应，临床上可能出现发热及内毒素休克等症状。在革兰阴性菌相关噬菌体制剂制备及纯化过程中，如不能有效清除内毒素成分，临床应用时可能会产生相应的不良反应，故需采用密度梯度离心和超滤过等相关技术清除内毒素，纯化噬菌体制剂。
噬菌体广泛应用于临床还需要关注一个问题：噬菌体制剂的制备与保存。目前临床上应用噬菌体治疗的均为危重、难治及高水平耐药致病菌引起的感染，大多数情况下没有足够的时间等待患者病原学结果再去制备个性化噬菌体制剂，这就需要利用现有"库存"制备相应的"鸡尾酒"制剂。研究所库存的噬菌体每半年进行测试与更新，这些方法值得我们借鉴，换言之，对于噬菌体治疗有需求的地方就应该建立相应的"噬菌体库"，以备临床应用；同时，除了需要更多、更完善的针对噬菌体临床应用剂量、频次及给药途径等具体问题的临床试验与研究外，寻求与发现更多种类的裂解性噬菌体也同样重要。
随着细菌耐药性迅速的提升以及抗菌药物研发的迟滞，寻找传统抗菌药物的替代疗法迫在眉睫。噬菌体治疗已有100多年的历史，虽然受到抗菌药物的影响而延缓了发展，但有限的临床研究结果已显示出其令人满意的临床疗效以及良好的安全性与耐受性，这足以使其成为最具潜力的抗感染替代及补充疗法。虽然临床广泛应用尚需时日，但在科技飞速发展的今天，相信很快就会找到解决问题的钥匙，开启噬菌体临床应用的大门。
参考文献（略）